1、固定

1.1植物組織

1)配置固定Buffer

2)實(shí)驗(yàn)步驟

A.收集4g新鮮、干凈、長(zhǎng)勢(shì)完全正常的幼嫩組織樣品（如有污物，需要提前處理干凈），并至于冰上

B.每2g收集的新鮮組織使用剪刀剪成碎片，各放置于一個(gè)50ml的離心管中

C.往50ml離心管中添加提前預(yù)冷的35ml固定Buffer和2ml 36%的甲醛溶液，室溫下，旋轉(zhuǎn)雜交爐或者其它可旋轉(zhuǎn)設(shè)備中旋轉(zhuǎn)反應(yīng)90min

D.加入2.5ml 2M的甘氨酸，使用脫色搖床100r混勻5min，終止交聯(lián)

E.濾掉固定液，用無(wú)菌ddH2O清洗幾次（至無(wú)泡沫）

F.吸干樣品表面水分，將樣品至于液氮中研磨

G.每4g研磨后的樣品存于一個(gè)50ml離心管中，并將離心管至于自封袋中，在-80℃保存?zhèn)溆?/p>

1.2動(dòng)物組織

1)取1g處理干凈的組織樣，將樣本置于液氮中充分研磨

2)將研磨后的組織置于預(yù)冷的50ml離心管中，加入30ml 1xPBS充分混勻

3)使用Falcon細(xì)胞網(wǎng)過(guò)篩2次（100um+40um），除去雜質(zhì)，收集濾液，加入35ul PMSF和適量的1x PBS，補(bǔ)至35ml

4)加入2ml 37%甲醛，室溫條件下置于旋轉(zhuǎn)搖床上反應(yīng)60min

5)加入2.5ml 2M的甘氨酸，使用脫色搖床100r混勻5min，終止交聯(lián)

6)3000g 4℃離心5min，棄掉上清保留沉淀

1.3速凍植物組織

1)取50mg速凍組織樣于2ml國(guó)產(chǎn)離心管中，加入鋼珠，使用打碎儀液氮充分研磨

2)在研磨后的組織中加入1ml的NIBuffer工作液1中，震蕩混勻之后過(guò)100um的濾網(wǎng)，補(bǔ)充適量的NIBuffer工作液1至全部過(guò)濾完成，使用50ml離心管收集濾液（冰上操作）

3)在濾液中加入巰基乙醇、PMSF和37%甲醛溶液，室溫雜交反應(yīng)一定時(shí)間

4)加入2.5ml 2M的甘氨酸，使用脫色搖床100r混勻5min，終止交聯(lián)

5)3000g 4℃離心5min，棄掉上清保留沉淀

1.4細(xì)胞

1)用1ml 1x PBS重懸細(xì)胞樣品（要求客戶(hù)自己固定完成），轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中

2)4℃ 650g離心10min，棄上清

3)將1ml Lysis Buffe 工作液加入到裝有樣品沉淀的離心管中，充分混勻，重懸樣品

4)離心管放在冰上，并置于搖床上100r，混勻15min

5)650g，4℃，離心10min，棄掉上清，保留沉淀

1.5血液

1)取1ml新鮮全血至50ml離心管中，加入3ml紅細(xì)胞裂解液，輕輕混勻

2)冰上放置15min（每5min顛倒混勻一次）

3)4℃450g離心10min，棄掉上清

4)加入2ml的紅細(xì)胞裂解液，輕輕混勻白細(xì)胞

5)4℃450g離心10min，棄掉上清

6)加入45ml 1XPBS，重懸沉淀

7)加入2.5ml37%甲醛，充分混勻，室溫旋轉(zhuǎn)雜交60min

8)加入2.5ml 2M的甘氨酸，使用脫色搖床100r混勻5min，終止交聯(lián)

9)650g 4℃離心5min，棄掉上清保留沉淀

2、細(xì)胞裂解和酶切

1)配置適當(dāng)裂解體系冰上裂解細(xì)胞

2)用梯度密度離心法從裂解的細(xì)胞中提取細(xì)胞核

3)用限制性?xún)?nèi)切酶酶切細(xì)胞核

3、末端標(biāo)記和平端連接

1)配置適當(dāng)標(biāo)記體系對(duì)末端標(biāo)記生物素

2)將補(bǔ)平的末端用T4 DNA連接酶進(jìn)行平末端連接

4、DNA純化（解交聯(lián)）

1)配置解交聯(lián)反應(yīng)試劑

2)將解交聯(lián)反應(yīng)試劑加入樣品中，充分混勻，金屬浴55℃，900rpm反應(yīng)30min

3)加入適量的NaCl溶液，充分混勻，金屬浴65℃，900rpm反應(yīng)90min

4)反應(yīng)結(jié)束后5000rpm室溫離心3min，取上清液至新的離心管中

5)加入XP磁珠，混勻瞬時(shí)離心，室溫孵育10min

6)將樣品放置于磁力架上，直到液體澄清

7)小心棄掉上清液，加入200ul新鮮配置的80%乙醇，靜置20s，棄掉上清液

8)重復(fù)步驟7

9)取下離心管，瞬時(shí)離心，吸干凈殘留的液體

10)室溫靜置3min，待磁珠表面呈現(xiàn)磨砂狀

11)將離心管從磁力架上取下來(lái)，加入85ul EB，充分混勻磁珠，室溫靜置5min

12)將離心管置于磁力架上，待到液體澄清，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中

5、Hi-C文庫(kù)制備（采用Mate-pair Kit）

5.1文庫(kù)制備流程

取1ug DNA樣品（體積最大取41ul）除去末端標(biāo)記但未連接的DNA，金屬浴反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)

1)Ampure XP磁珠純化DNA

A.取90ul的XP磁珠至上述反應(yīng)結(jié)束的離心管中，用移液器吹吸混勻，瞬離后室溫靜置5min

B.將樣品置于磁力架上，待液體澄清后，小心棄掉上清液

C.加入200ul新鮮配置的80%乙醇，室溫靜置20s，小心移除上清液

D.重復(fù)步驟C

E.取下樣品管，瞬時(shí)離心，吸干殘留的液體

F.將離心管重新置于磁力架上，室溫靜置2-4min，磁珠表面無(wú)明顯水珠即可

G.從磁力架上取下離心管，加入18ul NF水，混勻重懸磁珠，室溫孵育5min

H.將樣品置于磁力架上，待液體澄清后，小心吸取上清液至新的離心管中備用

2)片段化、末端修復(fù)及加A

A.取0.5ug（最大體積17ul）純化后的DNA

B.加入配置好的反應(yīng)試劑，混勻后瞬離

C.置于PCR儀中按照設(shè)置好的程序進(jìn)行反應(yīng)

3)接頭連接及純化

A.在反應(yīng)結(jié)束后的樣品中加入接頭連接需要的試劑

B.吹吸混勻，瞬離后置于PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)

C.在反應(yīng)結(jié)束的樣品中加入50ul的XP磁珠，混勻瞬離，室溫反應(yīng)5min

D.將樣品置于磁力架上，待液體澄清后，小心棄掉上清液

E.加入200ul新鮮配置的80%乙醇，室溫靜置20s，小心移除上清液

F.重復(fù)步驟E

G.取下樣品管，瞬時(shí)離心，吸干殘留的液體

H.將離心管重新置于磁力架上，室溫靜置2-4min，磁珠表面無(wú)明顯水珠即可

I.從磁力架上取下離心管，加入28ul NF水，混勻重懸磁珠，室溫孵育5min

J.直到液體澄清后小心轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中

4)目標(biāo)捕獲

A.使用TWB和BB試劑重懸C1磁珠

B.取10ul重懸后的使用BB溶解的磁珠，加入純化后的樣品中

C.混勻后置于旋轉(zhuǎn)的混勻儀反應(yīng)15min

5)PCR文庫(kù)擴(kuò)增及片段篩選

A.將樣品置于磁力架上，待液體澄清之后棄掉上清液

B.分別使用200ul的BB試劑和NEB試劑重懸磁珠

C.棄掉上清，瞬離，離心管置于磁力架上，用槍頭吸干殘留的液體

D.室溫靜置2-4min，至磁珠表面無(wú)明顯水珠

E.取下離心管，加入10ul的NF水，重懸磁珠，用于PCR擴(kuò)增

F.配置好PCR擴(kuò)增試劑后，混勻，連同磁珠一起置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增

G.PCR結(jié)束后，將樣品置于磁力架上，待液體澄清后吸取上清液至新的離心管中

H.補(bǔ)水至50ul，并加入30ul的XP磁珠，吹吸混勻室溫靜置5min

I.置于磁力架上，待液體澄清后，棄掉上清

J.加入200ul新鮮配置的80%乙醇，室溫靜置20s，小心移除上清液

K.重復(fù)步驟J

L.取下樣品管，瞬時(shí)離心，吸干殘留的液體

M.將離心管重新置于磁力架上，室溫靜置2-4min，磁珠表面無(wú)明顯水珠即可

N.取下樣品管，加入30ul的Elution Buffer，混勻，瞬離，室溫靜置5min

O.置于磁力架上，待液體澄清后吸取上清液進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢

5.2文庫(kù)質(zhì)檢

1)質(zhì)檢方法：文庫(kù)通過(guò) Qsep-400 進(jìn)行片段質(zhì)檢， 使用酶標(biāo)儀進(jìn)行文庫(kù)濃度的定量

2)庫(kù)檢標(biāo)準(zhǔn)：庫(kù)檢片段呈正態(tài)分布狀，300bp起峰，800bp落峰；片段無(wú)前后拖尾、無(wú)接頭、無(wú)雜峰；濃度大于1ng/ul

5.3建庫(kù)用試劑耗材

1)文庫(kù)構(gòu)建試劑盒：VAHTSTM Fg DNA Library Prep Kit? for I11umina 貨號(hào)ND617-02

2)產(chǎn)物純化磁珠：Agencourt? AMPure? XP，貨號(hào)A63882

3)質(zhì)檢使用試劑：Qsep400 標(biāo)準(zhǔn)DNA 卡夾

4)定量使用試劑：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml離心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul槍頭：Axygen

5.4建庫(kù)用設(shè)備

6、測(cè)序方法

測(cè)序設(shè)備：NovaSeq X plus

測(cè)序試劑盒：NovaSeqTMX? Series25B Rgt Kit

期刊：Nature

導(dǎo)讀

在細(xì)胞周期的中間階段，染色質(zhì)以分級(jí)結(jié)構(gòu)排列在核中，這在調(diào)節(jié)基因表達(dá)方面具有重要作用。但是，人類(lèi)胚胎發(fā)生過(guò)程中3D染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)仍然未知。在這里作者報(bào)告，與小鼠精子不同，人類(lèi)精子細(xì)胞不表達(dá)染色質(zhì)調(diào)節(jié)劑CTCF，其染色質(zhì)不包含拓?fù)潢P(guān)聯(lián)域（TADs）。人類(lèi)受精后，TAD結(jié)構(gòu)在胚胎發(fā)育過(guò)程中逐漸建立。此外，A / B區(qū)室化在人類(lèi)胚胎2細(xì)胞階段中消失，并在后續(xù)胚胎發(fā)育過(guò)程中重新建立。值得注意的是，阻斷合子基因組激活（ZGA）可以抑制人類(lèi)胚胎中TAD的建立，而不能抑制小鼠或果蠅中的TAD。值得注意的是，CTCF在ZGA之前以非常低的水平表達(dá)，然后在觀(guān)察到TAD時(shí)在ZGA階段高表達(dá)。CTCF基因被敲除后，胚胎中TAD結(jié)構(gòu)顯著減少，這表明合子基因組激活（ZGA）階段，人類(lèi)胚胎中的TAD建立需要CTCF表達(dá)。結(jié)果表明，CTCF在人類(lèi)胚胎發(fā)生過(guò)程中的3D染色質(zhì)結(jié)構(gòu)建立中具有關(guān)鍵作用。

實(shí)驗(yàn)方法

材料：小鼠精子和桑椹胚

方法：Hi-C, 免疫染色，DNA甲基化測(cè)序，ATAC-seq, RNA-seq，Smart-seq2

研究?jī)?nèi)容

1、人類(lèi)早期胚胎的TAD結(jié)構(gòu)

作者檢測(cè)了人類(lèi)精子和胚胎中的染色質(zhì)相互作用。但是沒(méi)有檢測(cè)到人類(lèi)2細(xì)胞胚胎中TAD結(jié)構(gòu)的特征性“三角”相互作用。在8細(xì)胞胚胎中這些相互作用的水平很低，并且在人類(lèi)胚胎發(fā)育過(guò)程中相互水平逐漸升高（圖1a）。為了排除read深度對(duì)分析的影響，在繪制每個(gè)階段的相互作用熱圖時(shí)，作者隨機(jī)選擇了相同數(shù)量的read。 作者進(jìn)一步調(diào)查了人類(lèi)胚胎發(fā)育過(guò)程中的TAD重編程。使用TAD分離分?jǐn)?shù)方法（Methods）來(lái)獲得TAD結(jié)構(gòu)和TAD邊界。即使read深度很低，也可以檢測(cè)到大多數(shù)TAD域。作者還計(jì)算了TAD信號(hào)和方向指數(shù)。本文的數(shù)據(jù)表明，TAD信號(hào)方差和方向指數(shù)在2細(xì)胞階段最低，并隨著發(fā)育而逐漸增加（圖1b）。為了排除人胚TAD分析中可能的實(shí)驗(yàn)偏差，本文使用了小鼠morula胚胎作為對(duì)照，將其與人2細(xì)胞，8細(xì)胞和morula胚胎混合。然后，為這些混合樣品構(gòu)建了Hi-C庫(kù)。同時(shí)，還為未與人類(lèi)樣品混合的小鼠桑morula胚胎生成了Hi-C庫(kù)。這些結(jié)果表明，混合樣品中的TAD結(jié)構(gòu)在人類(lèi)2細(xì)胞胚胎中仍然模糊不清，在8細(xì)胞胚胎和桑胚胎中變得更清晰，而所有摻入的小鼠morula胚胎均清晰可見(jiàn)TAD結(jié)構(gòu)。來(lái)自混合樣品的TAD信號(hào)分析支持了作者的發(fā)現(xiàn)，即TAD結(jié)構(gòu)在人類(lèi)胚胎發(fā)生過(guò)程中得以確立。
總之，這些數(shù)據(jù)表明，TAD結(jié)構(gòu)在人的2細(xì)胞胚胎中基本上不存在，在8細(xì)胞胚胎中很少存在，并且在胚胎發(fā)育過(guò)程中變得越來(lái)越明顯。

圖a 人類(lèi)精子，人類(lèi)胚胎和H1人類(lèi)ES細(xì)胞（hESCs）中高階染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相互作用熱圖，分辨率為40 kb（合并的生物學(xué)重復(fù)；n = 2-3）。

圖b 用相等數(shù)量的reads（每個(gè)階段從2-3個(gè)生物學(xué)復(fù)制中產(chǎn)生）計(jì)算出的人類(lèi)胚胎中TAD信號(hào)的相對(duì)方差。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)染色體。顯示P值；雙面Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)為平均值±s.e.m。

圖c 人類(lèi)胚胎中500kb分辨率的5號(hào)染色體的PC1值軌跡和Pearson相關(guān)熱圖，具有相同的read次數(shù)（每個(gè)階段2-3次生物復(fù)制）。

圖d 具有相同reads的人胚胎中的compartment強(qiáng)度。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，通過(guò)自舉獲得（n = 100）。通過(guò)單側(cè)t檢驗(yàn)計(jì)算P值。

圖1. 人類(lèi)精子和胚胎的三維染色質(zhì)結(jié)構(gòu)

2、人類(lèi)精子不包含傳統(tǒng)的TAD結(jié)構(gòu)

先前的研究表明，TAD結(jié)構(gòu)存在于成熟的小鼠精子中。令人驚訝的是，本文沒(méi)有在人類(lèi)精子中觀(guān)察到典型的三角TAD結(jié)構(gòu)（圖1a）。例如，人類(lèi)精子的HOXA簇區(qū)域沒(méi)有TAD邊界，但存在于人類(lèi)胚泡（圖2a）和小鼠精子中。為了驗(yàn)證該觀(guān)察結(jié)果，繪制了人類(lèi)精子和胚泡在不同讀取深度下的TAD信號(hào)方差。與小鼠精子和人類(lèi)胚泡不同，人類(lèi)精子系的y截距接近0（圖2b），表明人類(lèi)精子中不存在TAD。本文進(jìn)一步比較了人類(lèi)精子和小鼠精子之間相互作用插入物大小的密度，結(jié)果表明，人類(lèi)精子在4 Mb（中程）附近出現(xiàn)一個(gè)主峰，而小鼠精子在933 kb附近出現(xiàn)肩峰，在41 Mb左右出現(xiàn)遠(yuǎn)距離主峰。此外，人的精子和小鼠的精子之間的接觸概率衰減曲線(xiàn)也有差異。總之，這些結(jié)果表明人類(lèi)精子不含TAD。

為了排除潛在的實(shí)驗(yàn)偏見(jiàn)，本文將小鼠精子與人類(lèi)精子混合，并為精子混合物構(gòu)建了一個(gè)Hi-C庫(kù)（方法）。平行地，本文混合了人類(lèi)HeLa細(xì)胞和小鼠HT22細(xì)胞。與本文之前的結(jié)果一致，本研究在精子混合物中觀(guān)察到了來(lái)自小鼠精子而非人精子的TAD。相比之下，在人類(lèi)HeLa細(xì)胞和小鼠HT22細(xì)胞中均觀(guān)察到TAD結(jié)構(gòu)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了人類(lèi)精子中沒(méi)有TAD。
CTCF-cohesin復(fù)合物在高級(jí)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中具有重要作用。本研究調(diào)查了人類(lèi)和小鼠精子中CTCF和粘著蛋白的水平。RAD21是黏附蛋白復(fù)合物的一個(gè)亞基，存在于人類(lèi)和小鼠的精子中）;但是，在人類(lèi)精子中未檢測(cè)到CTCF，并且在使用短干擾RNA（siRNA）耗盡CTCF的細(xì)胞系中表達(dá)很弱，但是在小鼠精子，人類(lèi)和對(duì)照小鼠細(xì)胞系中檢測(cè)到了CTCF（圖2c）。由于CTCF的消耗會(huì)導(dǎo)致TAD結(jié)構(gòu)的破壞，因此CTCF的缺乏可能是人類(lèi)精子中TAD結(jié)構(gòu)喪失的基礎(chǔ)。

圖a 人類(lèi)精子和胚泡中HOXA簇周?chē)南嗷プ饔脽釄D，分辨率為10 kb（生物學(xué)重復(fù); n = 3）。

圖b 人精子和胚泡中TAD信號(hào)方差與read深度（1 /讀取次數(shù)）的線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)。在y軸上標(biāo)記了人類(lèi)胚泡和精子的回歸線(xiàn)的線(xiàn)性外推。在每個(gè)讀取深度進(jìn)行降采樣分析3次（n = 3）。

圖c 用Ponceau染色的小鼠精子，人精子和體細(xì)胞系中CTCF的Western印跡。黑色箭頭表示CTCF波段。每個(gè)樣品在兩個(gè)生物學(xué)獨(dú)立的重復(fù)樣本上重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

圖2. 人類(lèi)精子不包含傳統(tǒng)的TAD結(jié)構(gòu)

3、TAD邊界的建立

TAD結(jié)構(gòu)在人類(lèi)2細(xì)胞胚胎中并不明顯。但是，兩細(xì)胞胚胎中的某些區(qū)域顯示出絕緣子結(jié)合的跡象，可以分隔上游和下游相互作用。在胚胎后期，這些區(qū)域大部分成為T(mén)AD邊界（圖3a）; 這些區(qū)域因此可以被視為未成熟的TAD邊界。在這項(xiàng)研究中，本研究將未成熟的TAD邊界和成熟的TAD邊界都定義為絕緣邊界。然后，本研究分析了人類(lèi)胚胎發(fā)育過(guò)程中絕緣邊界的動(dòng)力學(xué)。本研究的數(shù)據(jù)表明，分別在2細(xì)胞，8細(xì)胞，morula 和胚泡階段分別形成635、905、317和306個(gè)絕緣邊界（圖3a）。本研究還在小鼠2細(xì)胞胚胎中發(fā)現(xiàn)了未成熟的TAD邊界，并確定了小鼠階段獲得的絕緣邊界。比較了人類(lèi)樣品中2細(xì)胞階段的絕緣邊界與胚泡階段的總邊界，結(jié)果表明2細(xì)胞邊界與胚泡邊界的30％重疊（圖3b）。本研究的數(shù)據(jù)還顯示ZGA階段包含胚泡中67％的邊界，這與小鼠模型中的比例相似（圖3b）。此外，當(dāng)將ZGA階段的人類(lèi)邊界與小鼠的邊界進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)存在明顯的重疊（圖3c）。例如，本研究在人和小鼠的ZGA階段發(fā)現(xiàn)了TTC1和CCNG1基因周?chē)慕^緣邊界。

接下來(lái)，作者試圖確定在早期階段優(yōu)先形成絕緣邊界的基因組區(qū)域。在2細(xì)胞階段首先獲得邊界的基因組區(qū)域與持家基因的距離小于在后期階段獲得邊界的邊界區(qū)域的距離（圖3d）。在小鼠胚胎中觀(guān)察到了類(lèi)似的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)表明，在較早階段獲得的絕緣邊界往往位于人和小鼠的看家基因周?chē)?。作者還發(fā)現(xiàn)邊界附近的管家基因的表達(dá)水平傾向于高于其他管家基因的表達(dá)水平。
據(jù)報(bào)道，重復(fù)元素與細(xì)胞系中的TAD邊界相關(guān)。因此，作者分析了胚胎中特定于階段獲得的邊界周?chē)貜?fù)元件的富集。作者的數(shù)據(jù)表明，在人類(lèi)早期階段，Alu重復(fù)序列（而不是LINE或MIR重復(fù)序列）（圖3e）富集在絕緣邊界周?chē)Ｔ谛∈笈咛ブ杏^(guān)察到了相似的結(jié)果。例如，在人類(lèi)或小鼠RAB5A基因周?chē)?細(xì)胞階段獲得的絕緣邊界被建立在A(yíng)lu密集區(qū)。此外，作者的數(shù)據(jù)表明AluS元素在2細(xì)胞階段獲得的絕緣邊界周?chē)叨雀患▓D3e）。此外，與其他階段相比，在2細(xì)胞階段獲得的絕緣邊界周?chē)腁luS重復(fù)序列在裂解階段得到了高度表達(dá)?？傮w而言，這些結(jié)果表明，人類(lèi)胚胎中絕緣的邊界傾向定位在A(yíng)lu密集區(qū)周?chē)?br />

圖a 絕緣得分的熱圖，以在特定階段（±1 Mb范圍）獲得的絕緣邊界為中心。n，特定階段獲得的絕緣邊界的數(shù)量；b，絕緣邊界中心。

圖b 相對(duì)于胚泡邊界數(shù)，每個(gè)階段中絕緣邊界數(shù)的累積百分比。

圖c 維恩圖，顯示人ZGA邊界和小鼠ZGA邊界之間的重疊（χ2檢驗(yàn)）。

圖d 累積分布函數(shù)圖，用于特定階段獲得的邊界與人類(lèi)胚胎中最接近的管家基因的距離（來(lái)自2-3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的合并數(shù)據(jù)）。虛線(xiàn)表示200 kb的距離。P = 3.24×10?8（2單元vs 8單元階段）; P = 9.95×10-8（2細(xì)胞期與桑ula鼠比較）; P = 3.83×10-11（2細(xì)胞期vs胚泡）;雙面Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)。

圖e 在人類(lèi)胚胎的特定階段獲得的絕緣邊界處AluS元素的富集。

圖3. 在人類(lèi)胚胎發(fā)育過(guò)程中建立絕緣邊界

4、TAD的建立依賴(lài)于ZGA以及CTCF調(diào)控染色體

先前的報(bào)道表明，TAD的建立獨(dú)立于小鼠和果蠅胚胎中的ZGA。作者調(diào)查了這些特征在人類(lèi)中是否保守。作者用α-amanitin處理人合子以抑制ZGA，并在8細(xì)胞階段收集了胚胎。令人驚訝的是，在經(jīng)過(guò)α-amanitin處理的8細(xì)胞胚胎中，TAD的結(jié)構(gòu)模糊不清（圖4a）。用α-amanitin處理的胚胎中TAD信號(hào)的相對(duì)方差也顯著低于未處理的8細(xì)胞胚胎（圖4b）。因此，在人類(lèi)胚胎中建立TAD需要ZGA。
接下來(lái)，作者旨在鑒定ZGA期間參與TAD建立的蛋白質(zhì)。粘著蛋白復(fù)合物和CTCF在高階染色體結(jié)構(gòu)中具有重要作用。因此，作者研究了這些蛋白質(zhì)表達(dá)的差異。粘附蛋白復(fù)合物的亞基，例如RAD21，已經(jīng)在ZGA之前在人類(lèi)胚胎中高度表達(dá)。相比之下，當(dāng)在人類(lèi)胚胎中首次觀(guān)察到TAD結(jié)構(gòu)時(shí)，CTCF的表達(dá)在ZGA階段之前非常有限，并且在8細(xì)胞階段急劇增加（圖4c）。在經(jīng)α-amanitin處理的8細(xì)胞胚胎中，CTCF表達(dá)受到抑制。一致地，免疫染色圖像顯示在2細(xì)胞核中幾乎未觀(guān)察到CTCF蛋白（圖4d）。CTCF明顯存在于未經(jīng)處理的8細(xì)胞核中，但在經(jīng)α-amanitin處理的8細(xì)胞核中卻不存在（圖4d）。這些結(jié)果表明CTCF表達(dá)需要人ZGA。
接下來(lái)，作者研究了在人類(lèi)胚胎中建立TAD對(duì)CTCF的需求。作者通過(guò)將CTCF siRNA（siCTCF）注入人受精卵來(lái)抑制CTCF的表達(dá)，并在morula期收集胚胎（圖4d）。值得注意的是，在siCTCF morula中幾乎沒(méi)有觀(guān)察到三角形TAD結(jié)構(gòu)（圖4e）。相對(duì)的TAD信號(hào)方差支持抑制siCTCF morula中TAD的建立。一致地，大多數(shù)TAD邊界在對(duì)照morula中消失，而在siCTCF morula中變?nèi)酢Ｒ虼?，本研究的?shù)據(jù)表明ZGA期間CTCF表達(dá)是人類(lèi)胚胎中TAD建立所必需的。

圖a 人8細(xì)胞和經(jīng)α-amanitin處理的8細(xì)胞胚胎中的相互作用熱圖。

圖b 人2細(xì)胞（n = 3），8細(xì)胞（n = 3）和經(jīng)α-amanitin處理的8細(xì)胞胚胎（n = 3）中TAD信號(hào)相對(duì)方差的箱形圖。方框顯示第25、50和75個(gè)百分位，胡須顯示1.5倍的四分位間距。***對(duì)于8細(xì)胞和α-amanitin處理過(guò)的8細(xì)胞之間的所有成對(duì)比較，校正后的P <0.001（帶有Benjamini-Hochberg多重檢驗(yàn)校正的雙面Wilcoxon秩和檢驗(yàn)）。

圖c 人類(lèi)胚胎發(fā)育過(guò)程中CTCF表達(dá)的動(dòng)態(tài)（來(lái)自參考文獻(xiàn)22的表達(dá)數(shù)據(jù)；每個(gè)階段3至20個(gè)細(xì)胞）。數(shù)據(jù)為平均值±s.e.m。RPKM，每百萬(wàn)個(gè)映射讀操作的每千個(gè)轉(zhuǎn)錄本的讀操作數(shù)。

圖d CTCF在人類(lèi)胚胎中的免疫熒光（n = 2-3）。比例尺40μm。

圖e 跟蹤未處理的對(duì)照morula和siCTCF morula中的TAD結(jié)構(gòu)，其中覆蓋了基因表達(dá)。

圖4. CTCF調(diào)控人類(lèi)胚胎中染色質(zhì)的建立

總結(jié)

盡管人類(lèi)和小鼠胚胎都顯示出高階染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的全基因組重編程，但人類(lèi)和小鼠胚胎之間的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)存在很大差異。本研究的數(shù)據(jù)為哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的建立提供了寶貴的資源和機(jī)制的見(jiàn)解。

文獻(xiàn)下載：

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/31801998
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目前Hi-C?技術(shù)主要的應(yīng)用方向是輔助基因組組裝和染色質(zhì)互作。輔助基因組組裝：在已有二代或三代組裝的Draft genome序列和已知染色體數(shù)目的前提下，利用Hi-C測(cè)序數(shù)據(jù)將Draft genome序列進(jìn)行染色體群組的劃分，并確定各序列在染色體上的順序和方向，使基因組組裝組裝水平提升到染色體水平。染色質(zhì)互作：利用Hi-C技術(shù)揭示基因組的一般結(jié)構(gòu)特征，包括從隔室（A/B Compartments）到拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域（TAD）,最后再到環(huán)（loop）的染色質(zhì)層級(jí)結(jié)構(gòu)；還可以與ATAC-seq、ChIP-seq、DNase-seq和RNA-seq等數(shù)據(jù)進(jìn)行多組學(xué)分析揭示基因組三維結(jié)構(gòu)與表觀(guān)遺傳修飾、基因密度和轉(zhuǎn)錄活性之間的關(guān)系。

說(shuō)到Hi-C輔助基因組組裝，百邁客還真是碩果累累呢！2018年就有三篇Nature Genetics和一篇Giga Science見(jiàn)刊，2019年才過(guò)去短短兩個(gè)多月，就已經(jīng)有2篇Molecular Plant見(jiàn)刊了，這成果真是可喜可賀??！

下面就聽(tīng)小編娓娓道來(lái)吧~~

研究背景

棉花是世界上最重要的商業(yè)作物之一，同時(shí)也是研究植物多倍化的有價(jià)值的資源。亞洲棉最可能在馬達(dá)加斯加或印度河流域文明（巴基斯坦摩亨佐達(dá)羅）開(kāi)始馴化，隨后分散到非洲和亞洲一些地區(qū)。亞洲棉最初在1000多年前作為觀(guān)賞植物引入中國(guó)。當(dāng)在地方的農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境適應(yīng)和人類(lèi)選擇影響的過(guò)程中，中國(guó)的Gossypium arboreum形成了獨(dú)特的地理種群，稱(chēng)之為“sinense cotton”。雖然棉花種植者已經(jīng)基于RFLP和SSR markers構(gòu)建了各種遺傳圖譜，但是G. arboreum和G. herbaceum優(yōu)良農(nóng)藝和經(jīng)濟(jì)性狀的基因尚未被鑒定。本研究中，利用了三代PacBio和Hi-C技術(shù)，重新組裝了高質(zhì)量的亞洲棉基因組，分析了243份二倍體棉花種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)和基因組分化趨勢(shì)，同時(shí)確定了一些有助于棉花皮棉產(chǎn)量遺傳改良的候選基因位點(diǎn)。

材料選擇

基因組測(cè)序材料：二倍體G. arboreum栽培品種cultivar Shixiya1（SXY1）；

自然群體材料選擇：243份棉花，包含230份亞洲棉G. arboretum和13份草棉G. herbaceum?[243份棉花選自國(guó)家種質(zhì)基因庫(kù)（中國(guó)安陽(yáng)），種植在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所（ICR，CAAS）的溫室中]，插入片段長(zhǎng)度500 bp；測(cè)序深度6X；

遺傳群體材料選擇：親本（GA0146和GA0149），測(cè)序深度20X；2個(gè)混池（F2群體，有絨型和無(wú)絨型各20個(gè)子代），測(cè)序深度30X；

測(cè)序策略：PacBio RSII和Illumina HiSeq 2500分析軟件：基因組組裝（Canu和Falcon；Quiver；Pbjelly）；TEs轉(zhuǎn)座元件注釋?zhuān)≧epeatScout，LTR-FINDER，MITE和PILER；Repbase；REPET；RepeatMasker）；基因預(yù)測(cè)注釋?zhuān)╣eMoMa；Augustus；PASA；EVidenceModeler；InterProScan）群體研究：比對(duì)注釋?zhuān)˙WA，Picard，GATK，ANNOVAR）；群體結(jié)構(gòu)分析（FastTree，PHYLIP，STRUCTURE）；連鎖不平衡分析（Haploview）；遺傳多樣性分析（π，F(xiàn)st）；全基因組關(guān)聯(lián)分析（EMMAX）；

主要研究結(jié)果

1、亞洲棉基因組組裝更新

利用三代測(cè)序儀PacBio平臺(tái)共獲得142.54Gb的原始數(shù)據(jù)，組裝1.71Gb亞洲棉基因組，Contig N50=1.1 Mb，最長(zhǎng)的Contig為12.37 Mb。利用Hi-C技術(shù)獲得超過(guò)20×的reads，將組裝的1573Mb的數(shù)據(jù)定位到13條染色體上，與已經(jīng)發(fā)表的基因組相比，當(dāng)Hi-C數(shù)據(jù)比對(duì)到更新的基因組后，對(duì)角線(xiàn)外的不一致性明顯減少（見(jiàn)圖1a和b）。

圖1，Hi-C數(shù)據(jù)在兩版亞洲棉基因組上的比對(duì)

注：a. Hi-C數(shù)據(jù)與亞洲棉原基因組比對(duì)；b. Hi-C數(shù)據(jù)與亞洲棉更新基因組比對(duì)

2、二倍體棉花群體遺傳進(jìn)化分析

共計(jì)選擇了243份二倍體棉花材料：230份亞洲棉G. arboreum?(A2)?和13份草棉G. herbaceum?(A1)，來(lái)自于中國(guó)南部(SC)，長(zhǎng)江(YZR)和黃河（YER）。以雷蒙德氏棉（G. raimondii）為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，G. herbaceum（草棉）和G. arboretum（亞洲棉）聚類(lèi)成2個(gè)獨(dú)立的群（見(jiàn)圖2a和b）。G. arboretum（亞洲棉）進(jìn)一步又分為SC，YZR和YER三個(gè)群，顯示了地理分布模式的差異，進(jìn)而利用PCA分析支持這一結(jié)果（見(jiàn)圖2c）。

圖2 二倍體棉花的群體分層分析

注：a，243份二倍體棉花系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；b，243份二倍體棉花的群體結(jié)構(gòu)分析c，PCA主成分分析（中國(guó)亞洲棉的PCA分析；亞洲棉和草棉的PCA分析）

3、選擇性清除分析與GWAS分析

人工選擇在農(nóng)作物的馴化和遷徙的過(guò)程中具有重要的作用。群體結(jié)構(gòu)分析顯示當(dāng)K=4時(shí)，YER與SC和YZR明顯不同（圖2b，K=4）。通過(guò)兩兩群體間的選擇性清除分析（FST）鑒定出了分別覆蓋到59，53和51個(gè)顯著遺傳分化的區(qū)域。SC和YZR之間的21個(gè)分化的區(qū)域（約43.5 Mb?含有915個(gè)基因）在群體SC和YER之間是保守的（圖3a）。對(duì)來(lái)自不同環(huán)境下的11個(gè)重要性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，在98個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的信號(hào)中，其中25信號(hào)個(gè)來(lái)自基因區(qū)（外顯子或內(nèi)含子區(qū)），包含與形態(tài)性狀相關(guān)的8個(gè)信號(hào)區(qū)，與產(chǎn)量性狀相關(guān)的6個(gè)信號(hào)區(qū)，與油籽性狀相關(guān)的3個(gè)信號(hào)區(qū)；剩余73個(gè)信號(hào)來(lái)自非編碼區(qū)。大部分農(nóng)藝性狀的GWAS關(guān)聯(lián)信號(hào)中顯示地理差異，如分支數(shù)，開(kāi)花期，鈴重和抗病性這些性狀定位在保守的基因區(qū)（圖4b）。

參考文獻(xiàn)：Du X, Huang G, He S, et al. Resequencing of 243 diploid cotton accessions based on an updated A genome identifies the genetic basis of key agronomic traits[J]. Nature genetics, 2018, 50(6): 796.

 

百邁客成功案例二：異源四倍體陸地棉和海島棉Hi-C輔助基因組組裝

英文題目：Reference genome sequences of two cultivated allotetraploid cottons?Gossypium hirsutum?and?Gossypium barbadense.

中文題目：兩個(gè)異源四倍體陸地棉和海島棉基因組破譯

發(fā)表期刊：Nature Genetics

發(fā)表時(shí)間：2018年12月

合作單位：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

研究方法：基因組、比較基因組分析、遺傳圖譜構(gòu)建及QTL定位等

研究背景

棉花是世界上最大的天然紡織纖維來(lái)源，每年纖維產(chǎn)量的90％以上來(lái)自異源四倍體棉花（G. hirsutum和G. barbadense），它起源于大約1-2百萬(wàn)年前的異源多樣化事件，隨后是數(shù)千年的不對(duì)稱(chēng)亞基因組選擇。陸地棉（G. hirsutum）由于其高產(chǎn)而在全世界種植。G. barbadense以其卓越的纖維質(zhì)量而受贊譽(yù)。為了培育產(chǎn)生纖維更長(zhǎng)，更細(xì)和更強(qiáng)韌的陸地棉（G. hirsutum）品種，一種合理有效的方法是將海島棉（G. barbadense）的優(yōu)良纖維性狀引入陸地棉?；蚪M學(xué)啟動(dòng)的育種策略需要對(duì)基因組組織進(jìn)行詳細(xì)而有力的理解。

材料選擇

高度純合陸地棉（TM-1)和海島棉（3-79），用于基因組測(cè)序；由陸地棉Emian22作為受體親本，海島棉3-79作為供體親本構(gòu)建包含168個(gè)個(gè)體的CSSLs群體，做重測(cè)序，平均深度?> 6×；13份二倍體D型基因組的棉花做重測(cè)序，平均深度?> 15×；Xuzhou 142與其自然突變體Xuzhou 142f1雜交，構(gòu)建F2群體，做混池測(cè)序。

測(cè)序策略：PacBio RS II、BioNano和Illumina HiSeq

分析軟件：

基因組組裝：Canu (version 1.3)?，BLASR (version 1.3.1)?，BWA (version 0.7.10-r789)?，Pilon(version 1.22)?；光學(xué)圖譜糾錯(cuò)：核酸內(nèi)切酶Nt.BssSI23，AutoDetect，IrysSolve；Hi-C染色體掛載：核酸內(nèi)切酶HindIII，BWA（version 0.7.10-r789），LACHESIS，HiC-Pro；基因組完整性評(píng)估：BUSCO評(píng)估；TE注釋?zhuān)?/strong>PASTEClassifier (version 1.0)；RepeatMasker (version 4.0.6)；基因預(yù)測(cè)和注釋?zhuān)?/strong>Genscan，Augustus (version 2.4)，GlimmerHMM (version 3.0.4)，GeneID (version 1.4)和SNAP (version 2006-07-28)；GeMoMa (version 1.3.1)；假基因組預(yù)測(cè)：GenBlastA (version 1.0.4)，GeneWise (version 2.4.1)；

著絲粒區(qū)域鑒定：blastn，SPSS software (version 17.0)?；基因組共線(xiàn)性分析：MUMmer (version 3.23)，GATK(version 3.1.1)，Samtools(version 0.1.19)?，MCScanX package；結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)：MUMmer3 (version 3.23)；二倍體棉重測(cè)序SNPs鑒定：Trimmomatic (version 0.32)，BWA；包含168個(gè)個(gè)體的CSSLs群體SNPs鑒定：BWA，GATK和Samtools；CSSLs群體QTLs定位與表達(dá)分析：QTL IciMapping (version 4.0)?；TopHat2 (version 2.0.13)?；Cufflinks (version 2.2.1)；STRUCTURE (version 2.3)?；TASSEL software (version 5.0)?；

主要研究結(jié)果

1、陸地棉Gossypium hirsutum和海島棉Gossypium barbadense基因組組裝及注釋

???本研究利用PacBio RSII、BioNano和Hi-C技術(shù)組裝出了高質(zhì)量的異源四倍體陸地棉G. hirsutum?acc. TM-1和海島棉G. barbadense?acc. 3-79基因組，最終組裝出26條染色體。在陸地棉和海島棉中分別預(yù)測(cè)到70,199和71,297個(gè)基因，PacBio數(shù)據(jù)分析顯示，在全基因組范圍內(nèi)陸地棉6mA甲基化占所有腺嘌呤的0.21%，海島棉占0.22%。且6mA甲基化修飾在每條染色體上是均勻分布的，而5mC修飾在染色體臂中分布較少（見(jiàn)圖1）。

圖1 陸地棉和海島棉染色體特征（含表觀(guān)遺傳標(biāo)記）

?2、陸地棉和海島棉染色體結(jié)構(gòu)變異分析

高質(zhì)量的參考基因組使研究人員直接通過(guò)比較基因組就能鑒定大的結(jié)構(gòu)變異成為可能。發(fā)現(xiàn)有170.2 Mb的基因組序列被鑒定為G. hirsutum和G. barbadense之間的倒位，包括120.4 Mb的At亞基因組和49.8 Mb的Dt在A(yíng)06染色體中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)大的倒位變異，包括3個(gè)染色體臂內(nèi)倒位（in1, in3 and in4）和1個(gè)染色體臂間倒位（in2），通過(guò)Hi-C數(shù)據(jù)在斷點(diǎn)周?chē)x散的染色質(zhì)相互作用（圖2a），突出了Hi-C技術(shù)識(shí)別大規(guī)模染色體重排的優(yōu)勢(shì)。光學(xué)圖（BioNano optical maps）譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了這些反轉(zhuǎn)斷裂位點(diǎn)（圖2b）。

 

圖2，陸地棉和海島棉A06染色體倒位鑒定

注：a，Hi-C互作熱圖；b，光學(xué)圖譜鑒定

3、漸滲系的構(gòu)建及QTLs定位

由陸地棉Emian22作為受體親本，海島棉3-79作為供體親本構(gòu)建包含168個(gè)個(gè)體的CSSLs群體，旨在引入有利的變異，如纖維質(zhì)量。QTL定位分析，共鑒定到5個(gè)性狀的13個(gè)QTLs位點(diǎn)，其中控制纖維長(zhǎng)度位點(diǎn)2個(gè)，控制纖維強(qiáng)度位點(diǎn)4個(gè)，馬克隆值位點(diǎn)2個(gè)，纖維伸長(zhǎng)率位點(diǎn)2個(gè)，纖維均勻度位點(diǎn)3個(gè)（圖3）。在這些QTLs位點(diǎn)中，9個(gè)位點(diǎn)之前未被鑒定出，通過(guò)檢驗(yàn)13個(gè)QTLs中的基因表達(dá)水平，研究人員檢測(cè)到了235個(gè)在纖維發(fā)育過(guò)程中高度表達(dá)的基因，同時(shí)還整合了基因組變異數(shù)據(jù)來(lái)預(yù)測(cè)候選基因，而這些基因值得進(jìn)一步進(jìn)行精細(xì)定位以確認(rèn)對(duì)這些性狀具有重要影響的基因。

圖4，QTL定位結(jié)果展示

注：a，陸地棉纖維質(zhì)量相關(guān)QTLs分布（紅框）；b，纖維長(zhǎng)度相關(guān)QTL定位；c，纖維伸長(zhǎng)率相關(guān)QTL定位

參考文獻(xiàn)：Wang M, Tu L, Yuan D, et al. Reference genome sequences of two cultivated allotetraploid cottons, Gossypium hirsutum and Gossypium barbadense[J]. Nature genetics, 2019, 51(2): 224.

 

英文題目：Allele-defined genome of the autopolyploid?sugarcane Saccharum spontaneum L.

中文題目：同源多倍體（Saccharum spontaneum L.）基因組等位基因鑒定

發(fā)表期刊：Nature Genetics

發(fā)表時(shí)間：2018年10月

合作單位：福建農(nóng)林大學(xué)基因組與生物技術(shù)研究中心

研究方法：基因組、比較基因組、群體遺傳進(jìn)化等

研究背景

栽培甘蔗（Saccharum?spp., Poaceae）相比其它主要作物與眾不同，因?yàn)樗嵌啾扼w種間雜種，具有極其復(fù)雜的基因組。目前甘蔗是世界上收獲量最大的第一作物和第五價(jià)值作物（FAO, 2012），甘蔗種植在90多個(gè)國(guó)家的約2600萬(wàn)公頃土地上，每年收獲18.3億公噸，總產(chǎn)值接近570億美元，提供80％的糖和40％的乙醇，作為主要的糖和生物燃料原料作物。雖然現(xiàn)代甘蔗栽培種的高含糖量來(lái)源于栽培種“S. officinarum”，但是它們的耐寒性，抗病性和再生能力更多的來(lái)自于與含糖量低的親本“S. spontaneum”的回交中。Saccharum officinarum品種（2n= 8x=80），在莖中積累蔗糖達(dá)到干重的50％，但是易受生物和非生物脅迫的影響。自然狀態(tài)記錄下染色體數(shù)目最少的S. spontaneum種質(zhì)（2n = 5x =?40）已經(jīng)不存在了，然而，由另一種八倍體SES208單倍化形成的S.spontaneum“AP85-441”（1n = 4x = 32）為甘蔗染色體的原型的組裝提供了基礎(chǔ)。本研究闡釋了最重要，復(fù)雜基因組的基因組作物S. spontaneum遺傳藍(lán)圖和進(jìn)化歷史。

材料選擇

S. spontaneum?AP85-441用于基因組測(cè)序；64份世界種質(zhì)資源庫(kù)材料進(jìn)行重測(cè)序；

測(cè)序策略：IlluminaHiSeq 2500和PacbioRSII

分析軟件：

基因組組裝：BAC文庫(kù)測(cè)序數(shù)據(jù)初步組裝（組裝軟件：ALLPATH-LG,SPAdes和SOAPdenovo2，保留組裝結(jié)果）；PacBio測(cè)序數(shù)據(jù)糾錯(cuò)組裝（CANUv1.5）；Hi-C染色體分群（ALLHIC）。

基因注釋?zhuān)?/strong>重復(fù)序列預(yù)測(cè)（RepeatModeler），TE轉(zhuǎn)座子序列鑒定（RepeatMaskerversion 4.05；TEclassversion 2.1.3），串聯(lián)重復(fù)序列分析（TRFpackageversion 4.07）；基因注釋?zhuān)∕AKER，JBrowse，Trinity，PASA，SNAP，GENEMARK，AUGUSTUS等）；注釋完整性評(píng)估（BUSCOversion 3）；

等位基因變異及優(yōu)勢(shì)表達(dá)分析：單倍體基因組構(gòu)建（nucmer，MUMmerpackage，Assemblytics）；等位基因鑒定（MCScanX，GMAP）；等位基因變異分析（nucmer，Assemblytics）；等位基因的優(yōu)勢(shì)表達(dá)（Trimmomatic，HiSAT2)。

重測(cè)序群體結(jié)構(gòu)分析：序列比對(duì)與變異檢測(cè)（Bowtie2，SAMtools，BWA，GATK，SnpEffv3.6c)；基因組遺傳多樣性評(píng)估（π，Tajima’sD）；PCA分析（VCFtools，PLINK）；系統(tǒng)發(fā)育分析（ML trees，PHYLIP package）；群體結(jié)構(gòu)分析（Admixture，STRUCTURE）；基因組重排區(qū)遺傳多樣性與不同多倍體種質(zhì)的基因組遺傳多樣性分析（π，SNP density，Tajima’sD）。

主要研究結(jié)果

1、基因組測(cè)序組裝

本研究中利用Illumina、PacBio和Hi-C技術(shù)，加之本研究團(tuán)隊(duì)研發(fā)的算法ALLHIC成功的將甘蔗基因組組裝到染色體水平，最終組裝出32條染色體，錨定了2.9 Gb基因組，涵蓋了97%的基因含量。進(jìn)一步利用998,370 SNPs的高密度遺傳圖譜來(lái)驗(yàn)證Hi-C組裝的結(jié)果，在兩種方法中，89%的contigs的順序是一致的。32條染色體中包含了8個(gè)同源組群和4組單倍型A，B，C和D（見(jiàn)圖1）。

圖1?S. spontaneum?AP85-441染色體與高粱染色體的比對(duì)

2、基礎(chǔ)染色體數(shù)目的減少

AP85-441基因組的組裝顯示了S. spontaneum的染色體數(shù)目從10降到8，而這與頻繁復(fù)制的古復(fù)制染色體對(duì)相關(guān)，通過(guò)與高粱的聚類(lèi)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)高粱祖先5號(hào)染色體和8號(hào)染色體同源物經(jīng)歷了染色體裂變（見(jiàn)圖2）。SbChr05（A12）的祖先染色體斷裂分為兩個(gè)主要部分，即C5S（A12S）和C5L（A12L），分別轉(zhuǎn)移到SbChr06（A2）和SbChr07（A5）的祖先染色體；SbChr8（A11）的祖先染色體斷裂為兩個(gè)主要的部分，即C8S（A11S）和C8L（A11L），分別轉(zhuǎn)移到SbChr09（A6）和SbChr02（A7 + A9）的祖先染色體中。SbChr8和SsChr5之間及SbChr5和SsChr7之間近乎同源的短片段是在高粱與甘蔗分化前，高粱SSA形成于13.4 MYA同源基因的殘留物，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，S5中較小的SSA區(qū)域和S8中SSA的較大區(qū)域在重排的AP85-441基因組中也是保守的。

圖2 禾本科染色體數(shù)進(jìn)化（高粱n = 10到甘蔗n = 8）

 

3、S. spontaneum的起源與遺傳多樣性分析

研究中對(duì)世界種質(zhì)資源庫(kù)的64份S. spontaneum材料進(jìn)行重測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其核苷酸多態(tài)性（π）[0.00021±0.000002 ]遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它克隆繁殖的作物，如馬鈴薯，木薯，葡萄和柑。通過(guò)PCA主成分分析及群體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)64份材料分為3個(gè)群，這些群體也受到自然和地理起源推斷的64份種質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的支持（見(jiàn)圖3），group1來(lái)源于菲律賓，印度尼西亞和巴布亞新幾內(nèi)亞；group2和group3來(lái)源于印度，巴基斯坦和伊朗?；蚪M倍性在三組中差異很大（從6x-16x）。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，表明不同的倍性可能是從祖先獨(dú)立進(jìn)化而來(lái)的。

圖3 64份甘蔗的群體結(jié)構(gòu)與進(jìn)化關(guān)系分析

參考文獻(xiàn)：Zhang J, Zhang X, Tang H, et al. Allele-defined genome of the autopolyploid sugarcane Saccharum spontaneum L[J]. Nature genetics, 2018, 50(11): 1565.

 

百邁客成功案例四：異源四倍體野生花生Hi-C輔助基因組組裝

英文題目：Genome of an allotetraploid wild peanut?Arachis monticola: a de novo assemble.

中文題目：異源四倍體野生花生（Arachis monticola）基因組組裝

發(fā)表期刊：Giga Science

發(fā)表時(shí)間：2018年6月

合作單位：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)

研究方法：基因組

研究背景

花生作為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是提供重要的蛋白和油料的基礎(chǔ)。作為豆科的重要分支之一，花生屬一共包括30個(gè)二倍體品種，1個(gè)異源四倍體野生花生(A.monticola)和1個(gè)異源四倍體栽培花生(A.hypogaea)(2n = 4x = 40)。作為栽培花生農(nóng)藝性狀改良的重要野生資源供體，野生四倍體花生的基因組也一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。成功破譯四倍體野生花生的基因組有助于科學(xué)家和育種專(zhuān)家對(duì)A.hypogaea起源及馴化過(guò)程的理解。

材料選擇

野生四倍體花生A.monticola；

測(cè)序策略：Illumina X-ten、PacbioRSII和Bionano

分析軟件：

基因組組裝：Canu v1.5，WTDBG，Pilon（v1.22），LoRDEC v0.5，F(xiàn)alcon v0.7，quickmerge v0.2，Allpath-LG v1.4，IrysView v2.5.1等；Hi-C染色體掛載：HiC-Pro，LACHESIS，Pbjerlly2，GapCloser，Pilon；基因組質(zhì)量評(píng)估：BUSCO pipeline v3.0.2?等。

主要研究結(jié)果

在這項(xiàng)研究中，研究人員以野生四倍體花生A.monticola為研究材料，進(jìn)行測(cè)序得到36X SMRT subreads + 76X HiC data + 210X Bionano Irys data + 50XIllumina reads的測(cè)序數(shù)據(jù)，整合多種組裝工具的優(yōu)勢(shì)，最終獲得了參考基因組水平的高質(zhì)量組裝結(jié)果。又利用BioNano和Hi-C等方法對(duì)基因組進(jìn)行區(qū)分最終A.monticola得到的subgenome與祖先A基因組A.duranensis、祖先B基因組A.ipaensis之間的比較。并利用Hi-C數(shù)據(jù)對(duì)獲得的基因組進(jìn)行準(zhǔn)確性評(píng)估（見(jiàn)圖1）。

圖1 四倍體野生花生及兩個(gè)二倍體祖先熱圖評(píng)估

參考文獻(xiàn)：Yin D, Ji C, Ma X, et al. Genome of an allotetraploid wild peanut Arachis monticola: a de novo assembly[J]. GigaScience, 2018, 7(6): giy066.

 

百邁客成功案例五：雜草稻Hi-C輔助基因組組裝

英文題目：Population Genomic Analysis and De novo Assembly Reveal the Origin of Weedy Rice as an Evolutionary Game.

中文題目：群體基因組分析結(jié)合從頭組裝揭示雜草稻作為進(jìn)化演繹的起源

發(fā)表期刊：Molecular Plant

發(fā)表時(shí)間：2019年1月

合作單位：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)

研究方法：基因組、比較基因組、群體遺傳進(jìn)化

研究背景

作物雜草化一直以來(lái)都是作物學(xué)領(lǐng)域的一大難題，尤其是雜草稻（Oryza sativa f. spontanea）的起源與演化，至今尚未破解。雜草稻具有很強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性，但其種群獨(dú)特的遺傳特征是如何被逐漸塑造的還不是十分清楚。在氣候快速變化和人口增長(zhǎng)的的世界，從雜草植物中分離基因?qū)μ岣弋a(chǎn)量和糧食安全至關(guān)重要。然而，由于缺乏雜草種的參考基因組，已經(jīng)極大地限制了優(yōu)良基因的發(fā)現(xiàn)和基因組結(jié)構(gòu)水平上水稻雜草性的遺傳基礎(chǔ)。由于亞洲高緯度雜草稻（WRAH）分布到水稻種植的北部邊界（N50°14′），并且經(jīng)歷了比栽培稻更強(qiáng)的選擇壓力，因此它強(qiáng)大的生態(tài)適應(yīng)性可以為栽培的遺傳優(yōu)良的水稻提供有利的基因資源。

材料選擇

研究中一共使用303個(gè)水稻樣本用于測(cè)序，包括從中國(guó)東北和日本北部的亞洲高緯度（WRAH）采樣的248種雜草稻中篩選出的48份核心資源；43份現(xiàn)在或已大面積種植的共存栽培稻商業(yè)品種（Japonica-C）；26份從粳稻核心種質(zhì)資源中篩選的溫帶粳稻地方品種（Japonica-L），在本研究中Japonica-M代表Japonica-C和Japonica-L的混合組。此外，本研究中還使用了145份秈型水稻樣本，包括136份地方品種和9份優(yōu)良品種以及其他3個(gè)典型的栽培稻亞群樣本（12份tropical?japonica、11份aus和3份aromatic）作者還收集了15份來(lái)自中國(guó)南方的中緯度雜草稻（WRSC）。

測(cè)序策略：Illumina Hiseq和PacBio

分析軟件：

303份水稻樣本的SLAF-seq結(jié)果SNP鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建：SOAP，MEGA 7.0；遺傳多樣性分析：BioPerl；QTL定位：利用親本W(wǎng)R04-6和Qishanzhan構(gòu)建F8RIL群體，包含168個(gè)子代，通過(guò)SLAF-seq技術(shù)HighMap軟件構(gòu)建遺傳圖譜和QTL定位；群體進(jìn)化推演分析：DIYABC v. 2.0.3

基因組組裝：Canu，WTDBG，Pilon（v1.22），bwa；Hi-C染色體掛載：bwa，LACHESIS，Pbjerlly2；重復(fù)注釋?zhuān)篖TR-FINDER v1.05，MITE-Hunter，Repeat Scout v1.0.5，PILER-DF v2.4，PASTEClassifier，RepeatMasker v4.0.6；蛋白編碼基因預(yù)測(cè)及評(píng)估：Genscan，Augustus v2.4，GlimmerHMM v3.0.4，GeneID v1.4，SNAP（version 2006-07-28），GeMoMa v1.3.1，PASA v2.0.2，EVM v1.1.1；非編碼RNA預(yù)測(cè)：tRNAscan-SE v1.3.1；假基因預(yù)測(cè)：GenBlastA v1.0.4，GeneWise v2.4.1；基因功能和motif注釋?zhuān)築LAST v2.2.31，BLAST2GO，InterProScan；結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)：MUMmer4；共線(xiàn)性分析：MCScanX；選擇壓力分析：PAML v4；

主要研究結(jié)果

1、系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究利用來(lái)自中國(guó)和日本的48份WRAH種系，43份與WRAH共存的溫帶粳稻品種（Japonica-C），26份中國(guó)溫帶粳稻品種（Japonica-L），四個(gè)典型的栽培稻亞群（12tropical?japonica，145?indica/xian,，11?aus和?3?aromatic），15份來(lái)自中國(guó)南方中緯度雜草稻（WRSC）以及已經(jīng)發(fā)表了全基因組SNP信息的30份野生祖先種，基于SLAF-seq共檢測(cè)到122,777個(gè)高質(zhì)量SNP，叫做122k-SNP，用于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建（見(jiàn)圖1）。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，WRAH在系統(tǒng)發(fā)育上不同于Japonica-C，并且與溫帶粳稻Japonica-L群體形成了明確分群；WRSC種質(zhì)與秈稻種質(zhì)劃分到一個(gè)亞群。

圖1 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

2、基因組測(cè)序、組裝及注釋

本研究基于單分子實(shí)時(shí)測(cè)序（SMRT）、高通量NGS和染色質(zhì)構(gòu)象捕獲（Hi-C）技術(shù)組裝了高質(zhì)量的亞洲高緯度雜草稻W(wǎng)R04-6基因組。最終組裝出染色體水平的高質(zhì)量基因組，包含12條染色體，大小為373.93Gb，contigN50位6.09Mb。最后，去除重復(fù)序列后通過(guò)從頭預(yù)測(cè)、同源預(yù)測(cè)和RNA-seq分析共獲得41,385個(gè)基因，有96.32%的基因在NR，KOG,，GO，KEGG，TrEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)中得到了注釋?zhuān)ㄒ?jiàn)圖3）。

圖3 Hi-C輔助基因組組裝熱圖

圖4 雜草稻基因組分布圖

3、比較基因組分析

利用OrthoMCL軟件檢測(cè)WR04-6、R498、Nipponbare和W1943（O. rufipogon）間核心的、非必須的和共有的基因家族。在WR04-6中鑒定到了909個(gè)擴(kuò)張的基因家族，并且通過(guò)通路分析顯示，這些基因在光合作用和呼吸作用中顯著富集（p<0.01），例如氧化磷酸化、光合作用和核糖體的KEGG途徑，考慮其可以作為遺傳改良的信號(hào)。以O. barthii作為外群構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)顯示W(wǎng)R04-6與粳稻祖先的分化時(shí)間估計(jì)在3,706ya（1,235ya-6,326ya），見(jiàn)圖4。

圖4 以O(shè). barthii作為外群構(gòu)建的最大似然樹(shù)

參考文獻(xiàn)：Sun J, Ma D, Tang L, et al. Population Genomic Analysis and De novo Assembly Reveal the Origin of Weedy Rice as an Evolutionary Game[J]. Molecular plant, 2019.

 

英文題目：A Chromosome-Scale Genome Assembly of Paper Mulberry (Broussonetia papyrifera) Reveals the Genetic Basis of Its Forage and Papermaking Usage.

中文題目：染色體水平的基因組揭示構(gòu)樹(shù)飼用和造紙的遺傳基礎(chǔ)

發(fā)表期刊：Molecular Plant

發(fā)表時(shí)間：2019年2月

合作單位：中國(guó)科學(xué)院植物研究所北方資源植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

研究方法：基因組、比較基因組等

研究背景

構(gòu)樹(shù)（Broussonetia papyrifera，2n=2x=26）屬于桑科（Moraceae）構(gòu)屬（Broussonetia）多年生喬木，是我國(guó)鄉(xiāng)土樹(shù)種和先鋒植物，有悠久的歷史和文化，因?yàn)椴虃愑盟旒埗澜缏劽?gòu)樹(shù)的樹(shù)皮和樹(shù)干是造紙的優(yōu)質(zhì)原料，樹(shù)葉還可以作為蛋白飼料，其根、莖、葉、果實(shí)及種子均可入藥，富含黃酮類(lèi)化合物；還是尾礦處理、生態(tài)綠化的理想樹(shù)種。然而，有關(guān)構(gòu)樹(shù)的研究主要集中于造紙、藥理藥化、養(yǎng)殖以及生態(tài)綠化等應(yīng)用方面，基礎(chǔ)生物學(xué)的研究很少。因此，構(gòu)樹(shù)栽培改良的第一步是獲得其遺傳背景，以便能更好地掌握其特有特征的生物學(xué)機(jī)制。

材料選擇

生長(zhǎng)5年的雌性構(gòu)樹(shù)用于基因組測(cè)序；基因組測(cè)序的雌性構(gòu)樹(shù)與未知雄性構(gòu)樹(shù)雜交，獲得包含120個(gè)F1個(gè)體的CP群體用于構(gòu)建遺傳圖譜輔助基因組組裝。

測(cè)序策略：Illumina Hiseq和PacBio

分析軟件：

基因組組裝注釋：基因組組裝：?ALLPATHS-LG，SSPACE，GapCloser，BioNano Genomics?，RefAligner，LoRDEC，Pbjelly，MAPS，ALLMAPS；Hi-C輔助基因組組裝：Hi-C-Pro，LACHESIS；基因組注釋?zhuān)篟epeatMasker (version open-4.0.5)，PILER (version 1.0)，RepeatScout (version 1.0.5)，LTR-finder，MITE，PASTEClassifer，PASA，AUGUSTUS（vertion 3.0.3），SNAP，GlimmerHMM，GeneID，Genescan (version 1.1.0)，），Genewise (version 2.2.0），TopHat2 (version 2.0.7)，Cufflinks (version 2.2.1)，GeneMarkS-T (version 5.1)，?Genewise；基因功能注釋?zhuān)琁nterProScan (version 5)，Hmmscan (HMMER, version 3.0)，BLAST2GO (version 2.5)，BLASTP，Trembl，tRNAscan-SE (version 1.3.1)，Infernal cmscan (version 1.1.1)。

比較基因組分析：直系同源基因鑒定：?OrthoMCL (version 2.0)；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建與分化時(shí)間估算：?MUSCLE、Gblocks (version 0.91b)和RaxML（version 8），MCMCTREE評(píng)估分化時(shí)間；基因家族擴(kuò)張和收縮分析：CAFE（vertion 3.1）；染色體共線(xiàn)性分析、4DTV檢測(cè)及Ks值計(jì)算：MCscan。

主要研究結(jié)果

1、基因組組裝與注釋

本研究使用Illumina HiSeq和PacBio Sequel測(cè)序平臺(tái)，用Hi-C、光學(xué)（BioNano Irys）和遺傳圖譜輔助，進(jìn)行雌性構(gòu)樹(shù)的基因組組裝。獲得染色體水平的高質(zhì)量構(gòu)樹(shù)基因組，其大小為386.93Mb，scaffold N50是29.48Mb，有99.25%（357.56Mb）的基因組被錨定在13條染色體上，Hi-C熱圖評(píng)估（見(jiàn)圖1）。一共預(yù)測(cè)了30,512個(gè)基因，98.09%與已知基因同源并且得到了功能上的注釋。

圖1 熱圖驗(yàn)證Hi-C輔助染色體組裝

??圖2 構(gòu)樹(shù)染色體分布圖

2、構(gòu)樹(shù)的基因組進(jìn)化

利用14個(gè)物種（無(wú)油樟、亞麻、毛楊、棉花、擬南芥、黃瓜、苜蓿、桑樹(shù)、構(gòu)樹(shù)、桃樹(shù)、葡萄、番茄、毛竹和玉米）的單拷貝直系同源基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)構(gòu)樹(shù)與桑樹(shù)在同一分支，在大約3100萬(wàn)年前與桑樹(shù)分開(kāi)，與桃子的分化時(shí)間在大約7800萬(wàn)年前（見(jiàn)圖3），該結(jié)果被4DTv的分析結(jié)果所證實(shí)，通過(guò)Ks分析進(jìn)一步得到證實(shí)。

圖3 14個(gè)物種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

根據(jù)已報(bào)道的雙子葉植物祖先和譜系特異性WGD，本研究推測(cè)，古六倍化始祖的21條染色體至少經(jīng)歷了11次大的染色體融和（cfus）和2次染色體裂變后產(chǎn)生了桑科中間狀態(tài)的12條始祖染色體（見(jiàn)圖4）。?？频氖甲嫒旧w的數(shù)目與葫蘆科和楊柳科是相似的，但是與薔薇科（n = 9）、豆科（n = 6）、錦葵科（n = 16）和茄科（n = 16）是不同的。進(jìn)化推演分析表明，構(gòu)樹(shù)的染色體是從?？频?2條始祖染色體經(jīng)27次融合和28次裂變重構(gòu)的，說(shuō)明構(gòu)樹(shù)基因組在進(jìn)化過(guò)程中至少經(jīng)歷了68次的染色體融合和裂變。

圖4 構(gòu)樹(shù)和其他6種植物基因組重構(gòu)的進(jìn)化推演

3、比較基因組分析

在構(gòu)樹(shù)基因組中共發(fā)現(xiàn)15,254個(gè)基因家族，與桑樹(shù)分化之后，有431個(gè)基因家族擴(kuò)張，230個(gè)基因家族收縮，表明在適應(yīng)進(jìn)化過(guò)程中，構(gòu)樹(shù)中更多的基因家族經(jīng)歷了擴(kuò)張而不是收縮。另外，與苜蓿、毛楊和甜橙相比，轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生明顯收縮（58個(gè)家族共1,342個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，占蛋白編碼基因的4.4%）。肌動(dòng)蛋白在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育的很多層面扮演著重要的角色，在酵母和很多動(dòng)物中，肌動(dòng)蛋白僅被一個(gè)單基因編碼。在構(gòu)樹(shù)中僅發(fā)現(xiàn)4個(gè)肌動(dòng)蛋白，少于藻類(lèi)、小立碗蘚和無(wú)油樟。

參考文獻(xiàn)：Peng X, Liu H, Chen P, et al. A Chromosome-Scale Genome Assembly of Paper Mulberry (Broussonetia papyrifera) Provides New Insights into Its Forage and Papermaking Usage[J].?Molecular plant, 2019.

百邁客HI-C研究?jī)?yōu)勢(shì)百邁客自2016年初以來(lái)，利用Hi-C技術(shù)進(jìn)行染色體水平的基因組組裝及染色體三維構(gòu)象的研究，成功開(kāi)發(fā)出六堿基、四堿基酶切方案，組裝、互作輕松拿下。在植物Hi-C領(lǐng)域，更是邁進(jìn)了一大步，在同行還只能處理植物活體樣本的時(shí)候，我們已經(jīng)可以輕松“駕馭”離體枝條。迄今為止，保持著近100%的建庫(kù)成功率，完成近300個(gè)物種，近千個(gè)文庫(kù)構(gòu)建；文庫(kù)含酶切位點(diǎn)的有效數(shù)據(jù)比例最高達(dá)93%以上，平均比例高達(dá)68%。另外百邁客在Hi-C技術(shù)方面獲得一個(gè)專(zhuān)利和兩個(gè)軟著。Nature Genetics、Nature Communications、Molecular Plant等一大波Hi-C的高分文章在審稿或已接收的路上，后續(xù)會(huì)陸續(xù)與大家見(jiàn)面，敬請(qǐng)期待~~

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