?2018年12月4日，華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室張獻龍課題組首次通過三代測序（PacBio）+光學圖譜（BioNano）+Hi-C技術(shù)完成了異源四倍體陸地棉（Gossypium hirsutum）和海島棉（Gossypium barbadense）基因組組裝。該研究成果刊登于Nature Genetics，文中利用北京百邁客生物科技有限公司的三代PacBio測序組裝及Hi-C染色體掛載技術(shù)，組裝獲得了高質(zhì)量栽培種異源多倍體棉基因組。>>下載文獻全文

摘要

異源四倍體陸地棉和海島棉（Gossypium hirsutum和Gossypium barbadense）長期以來一直在世界范圍內(nèi)種植，由于其具有天然可再生紡織纖維。雖然以前利用二代測序技術(shù)組裝的陸地棉和海島棉基因組在棉花研究中應用較高，但是其基因組高度片段化且不完整。本研究中進行了異源四倍體基因組的升級，利用了三代測序組裝技術(shù)（single-molecule real-time sequencing）+光學圖譜（BioNano optical mapping）+Hi-C染色體掛載技術(shù)（high-throughput chromosome conformation capture techniques），實現(xiàn)了異源四倍體陸地棉G. hirsutum?acc. Texas Marker-1 (TM-1)?和海島棉G. barbadense?acc. 3-79基因組的組裝。與之前的二代基因組相比，三代陸地棉和海島棉基因組具有高度連續(xù)性，高度重復區(qū)（如著絲粒）具有更高的完整性。比較基因組學分析確定了廣泛的結(jié)構(gòu)變異可能發(fā)生在多倍化后，在14條染色體臂內(nèi)和臂間的倒位十分突出。研究中構(gòu)建了漸滲系群體，以導入從海島棉到陸地棉的有利染色體片段。從而使得研究人員可以識別與優(yōu)質(zhì)纖維質(zhì)量相關(guān)的13個數(shù)量性狀基因座。?這些資源將加速棉花的進化和功能基因組研究，并為未來的纖維改良育種計劃提供新的信息。

研究背景

棉花是世界上*大的天然紡織纖維來源，每年纖維產(chǎn)量的90％以上來自異源四倍體棉花（G. hirsutum和G. barbadense），它起源于大約1-2百萬年前的異源多樣化事件，隨后是數(shù)千年的不對稱亞基因組選擇。陸地棉（G. hirsutum）由于其高產(chǎn)而在全世界種植。G. barbadense以其卓越的纖維質(zhì)量而受贊譽。為了培育產(chǎn)生纖維更長，更細和更強韌的陸地棉（G. hirsutum）品種，一種合理有效的方法是將海島棉（G. barbadense）的優(yōu)良纖維性狀引入陸地棉。基因組學啟動的育種策略需要對基因組組織進行詳細而有力的理解。

材料方法

材料：高度純合陸地棉（Texas Marker-1；TM-1)?；海島棉（3-79）；
基因組denovo策略：三代測序組裝（PacBio RS II，SMRT）+光學圖譜（BioNano optical mapping）+Hi-C染色體掛載；
研究方法：基因組組裝：Canu (version 1.3)?，BLASR (version 1.3.1)?，BWA (version 0.7.10-r789)?，Pilon?(version 1.22)?；光學圖譜糾錯：核酸內(nèi)切酶Nt.BssSI23，AutoDetect，IrysSolve；Hi-C染色體掛載：核酸內(nèi)切酶HindIII，BWA（version 0.7.10-r789），LACHESIS，HiC-Pro；基因組完整性評估：BUSCO評估；TE注釋：PASTEClassifier (version 1.0)；RepeatMasker (version 4.0.6)；基因預測和注釋：Genscan，Augustus (version 2.4)，GlimmerHMM (version 3.0.4)，GeneID (version 1.4)和SNAP (version 2006-07-28)；GeMoMa (version 1.3.1)；假基因組預測：GenBlastA (version 1.0.4)，GeneWise (version 2.4.1)；
著絲粒區(qū)域鑒定：blastn，SPSS software (version 17.0)?；基因組共線性分析：MUMmer (version 3.23)，GATK(version 3.1.1)，Samtools(version 0.1.19)?，MCScanX package；結(jié)構(gòu)變異檢測：MUMmer3 (version 3.23)；二倍體棉重測序SNPs鑒定：Trimmomatic (version 0.32)，BWA；168個CSSLs群體SNPs鑒定：染色體片段置換系（CSSLs）的構(gòu)建（圖1），測序深度（6X)，插入片段：350 bp，BWA，GATK和Samtools；CSSLs群體QTLs定位與表達分析：QTL IciMapping (version 4.0)?；TopHat2 (version 2.0.13)?；Cufflinks (version 2.2.1)；STRUCTURE (version 2.3)?；TASSEL software (version 5.0)?；

圖1?棉花漸深系構(gòu)建流程

研究結(jié)果

表1?陸地棉和海島棉基因組組裝注釋

? ? ??基因組高度連續(xù)性與完整性的組裝使得高重復區(qū)的組裝具有顯著的改善。研究中成功地組裝了每條染色體的著絲粒區(qū)域，通過分析著絲粒相關(guān)的長末端重復（LTR）反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子對著絲粒區(qū)域進行了鑒定，基于之前的Illumina短讀長序列，G. hirsutum中的大部分LTR是缺失的。然而，這些區(qū)域的確具有顯著高含量的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列。

3.Gossypium hirsutum和Gossypium barbadense全基因組變異分析

? ? ? SNPs和InDels變異分析：通過兩個棉花基因組之間的序列比較以確定陸地棉和海島棉兩種代表性種質(zhì)之間的基因組差異。共鑒定了12,816,698個SNPs，平均每kilobase含5.89個SNPs。A亞基因組（At）的SNP頻率為8,131,276（5.95 / Kb），略大于D-亞基因組（Dt）中的SNP頻率4,685,422。染色體中SNP的分布與比較群體基因組研究中的發(fā)現(xiàn)相似，包括染色體A01中基因組變異的顯著減少（圖3）。研究中同時鑒定了2,682,689個小插入/缺失（InDels），平均每Kb為1.2個。預測這些SNPs和InDels對陸地棉的總共14,076個基因和海島棉的14,880個基因具有很大的功能影響，進一步利用了兩個基因組間的這些變異數(shù)據(jù)，鑒定了4,039基因受到了正向選擇(Ka/Ks >1)，這些基因在幾種生物途徑中過量表達，包括Ras / ARF蛋白信號轉(zhuǎn)導途徑。值得注意的是，觀察到在陸地棉G. hirsutum?基因組草圖序列中的缺失區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了6.5％的SNPs和7.2％的InDels，代表了四倍體棉的先前未檢測到的遺傳變異。
? ? ? 染色體結(jié)構(gòu)變異分析：高質(zhì)量的參考基因組使得研究人員能夠通過對兩種種質(zhì)的直接比較基因組分析來鑒定大的結(jié)構(gòu)變異。發(fā)現(xiàn)有170.2 Mb的基因組序列被鑒定為G. hirsutum和G. barbadense之間的反轉(zhuǎn)，包括120.4 Mb的At亞基因組和49.8 Mb的Dt。有趣的是，在異染色質(zhì)中，第四條和第十一條染色體中顯示出了染色體臂內(nèi)倒位。研究中在A06染色體中發(fā)現(xiàn)了4個大的倒位變異，包括3個染色體臂內(nèi)倒位（in1, in3 and in4）和1個染色體臂間倒位（in2），通過Hi-C數(shù)據(jù)在斷點周圍離散的染色質(zhì)相互作用（圖3），突出了Hi-C技術(shù)識別大規(guī)模染色體重排的優(yōu)勢。光學圖（BioNano optical maps）譜數(shù)據(jù)進一步支持了這些反轉(zhuǎn)斷裂位點（圖3）。此外，發(fā)現(xiàn)在D12染色體上，存在1個大的染色體臂間倒位。在棉花中這些染色體臂間／染色體臂內(nèi)的大量變異需要進一步探索其生物學功能，如在擬南芥，小麥和人中所述。研究人員同時還檢測到3,820個染色體易位（1,074個染色體內(nèi)易位，占據(jù)3.8 Mb；2,746個染色體間易位，占6.8 Mb）。

圖3?陸地棉和海島棉A06染色體倒位鑒定（左：Hi-C互作熱圖；右：光學圖譜鑒定）

? ? ? PAVs分析：?通過陸地棉（Gossypium hirsutum）和海島棉（Gossypium barbadense）基因組比較分析發(fā)現(xiàn)presence/absence變異?(PAVs)。研究人員在陸地棉中鑒定了9,135個片段，其總長度為179.9 Mb，在海島棉中不存在，而在海島棉中的7,710個區(qū)段，總長度為139.8 Mb，在陸地棉中不存在（圖4），同時發(fā)現(xiàn)陸地棉中的1,844個基因和海島棉中的1,614個基因位于這些PAV區(qū)域，在這些基因中，有220個基因在海島棉纖維發(fā)育過程中高度特異性表達。此外還發(fā)現(xiàn)在海島棉EXPANSIN基因的第3個外顯子中有450 bp片段的缺失，這導致多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的喪失。有意思的是，截短的蛋白正與海島棉中優(yōu)良纖維質(zhì)量的形成相關(guān)。

圖4?陸地棉和海島棉基因組中的PAVs變異分析

4.Gossypium hirsutum和Gossypium barbadense多倍化過程中發(fā)生的變異

四倍體陸地棉和海島棉基因組的組裝使得研究人員能夠進一步探索四倍體棉亞基因組和其二倍體祖先之間的基因組差異。首先通過對具有D型基因組的13份二倍體材料進行重測序分析，分析顯示在兩種四倍體棉D-亞基因組具有相同的二倍體祖先種雷蒙德氏棉G. raimondii（D5 genome，D亞基因組供體）；進而利用二倍體雷蒙德氏棉G. raimondii直接進行基因組比較分析，發(fā)現(xiàn)四倍體陸地棉和海島棉與雷蒙德氏棉相比，都有一些獨特的結(jié)構(gòu)變異，如在海島棉染色體D05和陸地棉D12中均存在大的染色體臂間倒位，暗示這些變異出現(xiàn)在多倍化之后（圖5）。研究人員還觀察到兩個四倍體相對于G. raimondii共有一些結(jié)構(gòu)變異，例如染色體D09中兩個四倍體發(fā)生了大的反轉(zhuǎn)（圖5）。研究中同時運用了二倍體祖先種亞洲棉G. arboreum（A2 genome，A亞基因組供體）的Hi-C數(shù)據(jù)，與陸地棉和海島棉A亞基因組進行比對，檢測棉由二倍體到四倍體多倍化過程中發(fā)生的結(jié)構(gòu)變異，Hi-C具體矩陣圖顯示在13條染色體中發(fā)生了大規(guī)模的染色體重排，其中發(fā)部分變異為兩個四倍體的棉的A亞基因組共有。研究中發(fā)現(xiàn)染色體A06中*大的染色體臂間倒位（in2）在陸地棉中是特有的（圖3?左），表明這種結(jié)構(gòu)變異可能在染色體多倍化后發(fā)生。因此得出結(jié)論，二倍體棉花中的A基因組在異源多倍化后被重組，導致不同四倍體（陸地棉和海島棉）中發(fā)生了大染色體倒位。

圖5?陸地棉和海島棉D亞基因組與雷蒙德氏棉（DD型）基因組共線性分析

5.Gossypium hirsutum漸滲系構(gòu)建及QTLs定位

通過研究發(fā)現(xiàn)了在陸地棉（G.?hirsutum?acc. TM-1）和海島棉（G. barbadense?acc. 3-79）間存在廣泛的遺傳變異，進一步推測這些變異的一部分可能是造成表型差異的原因，包括纖維性狀。為了利用這些變異進行定向育種，研究人員構(gòu)建了一個漸滲系群體，旨在引入有利的變異，控制從G.barbadense到G. hirsutum等重要農(nóng)藝性狀的形成，如纖維質(zhì)量。研究人員通過分子標記對168份漸滲系材料進行測序，并鑒定了涵蓋所有26條染色體的466個基因滲入片段（圖6）。研究人員發(fā)現(xiàn)了在染色體D12中含有漸滲片段的漸滲系，其具有有限的絨毛纖維，類似于其供體親本G.barbadense?3-79（圖6，圖7上），基因滲入片段的位置與無絨天然突變體G. hirsutum?Xuzhou142fl的圖譜測序所示的位置相同，然而其遺傳基礎以前未被充分了解（圖7下）。這些結(jié)果表明，陸地棉（G. hirsutum）中無絨毛突變體的遺傳變異與海島棉（G. barbadense）中的數(shù)量性狀基因座（QTL）共定位。該漸滲片段與天然纖維突變體的特征將有助于比較分析海島棉和陸地棉之間的絨毛纖維起始機制。

圖6?棉花群體漸滲系構(gòu)建???????????圖7?漸滲系N29纖維特征（上）；海島棉Xuzhou142fl測序比對結(jié)果（下）

為了鑒定海島棉（G. barbadense）中優(yōu)質(zhì)纖維質(zhì)量的有益等位基因，研究人員對漸滲群體中的纖維品質(zhì)相關(guān)性狀進行了QTL分析。研究中共計鑒定了5個性狀的13個QTLs位點，其中控制纖維長度位點2個，控制纖維強度位點4個，馬克隆值位點2個，纖維伸長率位點2個，纖維均勻度位點3個（圖8 a-c）。在這些QTLs位點中，9個位點之前未被鑒定出，通過檢驗13個QTLs中的基因表達水平，研究人員檢測到了235個在纖維發(fā)育過程中高度表達的基因，同時還整合了基因組變異數(shù)據(jù)來預測候選基因，而這些基因值得進一步進行精細定位以確認對這些性狀具有重要影響的基因。研究人員發(fā)現(xiàn)A02染色體上的1個QTL位點與纖維長度相關(guān)，在這個QTL中，一個未鑒定過的基因（Ghir_A02G003440），編碼預測的糖基磷脂酰肌醇錨定的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白，該基因在纖維伸長期的表達水平和深入系中纖維長度呈負相關(guān)，并可能與海島棉中長纖維的發(fā)育相關(guān)。這些QTL數(shù)據(jù)為海島棉基因組片段的詳細功能分析提供了框架，并應通過基因滲入育種進一步開發(fā)具有優(yōu)質(zhì)性狀的栽培棉花。

??為了深入研究這些基因可能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，研究人員對這168個漸滲系在開花后10天（DPA）對纖維的轉(zhuǎn)錄組進行了測序，在235個基因中，鑒定了125個QTLs位點（eQTL上）。發(fā)現(xiàn)在染色體A02（如上所述）上的QTL位點與D09號染色體上的2個基因的表達相關(guān)(Ghir_D09G014120和?Ghir_D09G014460)?，這2個基因分別編碼泛素延伸蛋白和微管相關(guān)蛋白，且預測這2個基因可能作為纖維強度的候選基因。通過eQTLs研究表明這些基因的表達可能與某些長距離的或染色體間的基因座位相關(guān)。

總結(jié)

通過陸地棉（Gossypium hirsutum）和海島棉（Gossypium barbadense）兩種栽培棉種質(zhì)基因組的重新組裝，研究人員鑒定了大量的變異，這些變異應與其它種質(zhì)的基因組分析相結(jié)合，以充分挖掘兩種種質(zhì)基因組間的差異。研究人員通過構(gòu)建滲入系，在兩種代表性種質(zhì)間探索研究了具有潛在優(yōu)質(zhì)纖維質(zhì)量性狀的基因組序列信息，而這在棉花育種中，可用于理想性狀的培育；這些資源將極大的促進棉花功能基因組學與進化基因組學的研究，并將為棉花纖維質(zhì)量的改良提供信息。
回顧整個2018年，百邁客NG文章收獲滿滿，于2018年5月與中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所杜雄明研究員合作成功完成了亞洲棉基因組的升級，又在2018年10月與福建農(nóng)林大學基因組研究中心明瑞光課題組合作，完成了同源多倍體甘蔗基因組密碼的破譯。同時，于2018年巨資投入，引進三代測序Nanopore單分子納米孔測序儀，成為了國內(nèi)動植物基因組denovo研究第一家。

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